در جنگ تحمیلی، ستون پنجم با اقداماتی نظیر لو دادن زمان عملیات و محل استقرار نیروهای ایران، سوءقصد به رزمندگان، اقدامات خرابکارانه و پناهندگی، با حکومت بعث عراق همکاری می‌کرد.

کاربرد ‌اصطلاح «ستون ‌پنجم‌» در ادبیات نظامی، از ‌هنگامی آغاز ‌شد ‌که ‌ژنرال ‌فرانکو، آن را ‌درباره نیروهای هوادار ‌خود در شهر ‌مادرید بر زبان آورد و در مرحله پایانی جنگ داخلی اسپانیا به خبرنگاران گفت: «نیروهای زیر فرمان من ‌در چهار ‌ستون از چهارسو به پایتخت یورش می‌برند، اما ستون پنجمی هم از درون شهر ‌به آنان خواهد ‌پیوست و دشمن را در هم خواهد شکست». از آن هنگام، ستون پنجم به نیروهایی گفته ‌می‌شود که ‌در ‌پشت ‌جبهه یا از ‌درون ‌حکومت، همگام ‌با ‌دشمن ‌بر ‌آن ‌ضربه بزنند و زمینه شکست آن را فراهم می‌آورند.⁠[1]

پیش از پیروزی انقلاب اسلامی، مواردی از نقش‌آفرینی ستون پنجم به نفع نیروهای بیگانه وجود داشت، چنان ‌که در ماجرای نهضت جنگل، افرادی با نفوذ به حلقه اول اطرافیان میرزاکوچک خان جنگلی، ضرباتی به نهضت میرزا وارد آورده و در نهایت وی را به شهادت رساندند.⁠[2]

با پیروزی انقلاب اسلامی نیز، ستون پنجم به منظور ضربه زدن به جمهوری اسلامی، دست به اقداماتی زد. پس از تسخیر لانه جاسوسی آمریکا در تهران توسط دانشجویان پیرو خط امام، اسنادی منتشر شد که نشان می‌داد برخی چهره‌های فرهنگی و سیاسی نظیر شهرام همایون (مدیرمسئول روزنامه بامداد)، فریبرز عطارپور (از سردبیران تهران ژورنال)، علیرضا فرهمند (دبیر سرویس خارجی روزنامه کیهان)، مسعود مهاجر (از مسئولین تحریریه روزنامه آیندگان)، رحمت‌الله مقدم مراغه‌ای (استاندار آذربایجان شرقی در دولت موقت و عضو مجلس خبرگان قانون اساسی) و حسن نزیه (رئیس کانون وکلای دادگستری و اولین رئیس شرکت ملی نفت در دولت موقت)، برای حفظ منافع آمریکا در کشور فعالیت می‌کردند.⁠[3] سیدمحمدرضا سعادتی از نیروهای رده‌بالای سازمان مجاهدین خلق نیز پس از پیروزی انقلاب اسلامی، در نقش ستون پنجم برای اتحاد جماهیر شوروی جاسوسی می‌کرد که 6 اردیبهشت 1358 و حین ملاقات با مأمور سفارت شوروی در تهران به همراه کیف حاوی اسناد و مدارک دستگیر شد.⁠[4]

«سازمان سیاسی خلق عرب» نیز از جمله گروه‌هایی بود که در آستانه جنگ تحمیلی، ستون پنجم حکومت بعث عراق بود و با ایجاد شورش و ناامنی در خوزستان، سعی در تجزیه این استان داشت.⁠[5] در جنگ تحمیلی، افرادی از گروه‌های مختلف سیاسی، با اقدامات خرابکارانه نظامی، امنیتی و سیاسی با صدام همکاری می‌کردند.

اقدامات ستون پنجم در جنگ تحمیلی، در دو بخش «مناطق جنگی» و «پشت جبهه» بود.

در مناطق عملیاتی، نیروهای ستون پنجم با نفوذ بین مدافعان شهر آبادان و لو دادن محل استقرار آنها،⁠[6] فعالیت کردند و با دادن اطلاعات نظامی حساس به دشمن، ضربه‌های بسیاری وارد کردند. ستون پنجم با لو دادن عملیات‌های شهیدان رجایی و باهنر (11 شهریور 1360)،⁠[7] والفجر مقدماتی (17 بهمن 1361)⁠[8] و کربلای 4 (3 دی 1365)⁠[9] باعث شهادت، مجروحیت و اسارت بیش از 20.842 نفر از نیروهای مسلح ایران شد.⁠[10]

پیش از عملیات شهیدان رجایی و باهنر، وحید حاجیلو، نفوذی سازمان مجاهدین خلق (منافقین) در روابط عمومی سپاه همدان که در تمامی مراحل شناسایی عملیات شرکت داشت، به بهانه چاپ متون تبلیغاتی برای رزمندگان، به تهران رفت و اطلاعات مربوط به عملیات را از طریق رابط خود در سازمان مجاهدین خلق، به عراق ارسال کرد؛ حاجیلو پس از شناسایی توسط سپاه پاسداران، به حکم دادگاه انقلاب تهران اعدام شد.⁠[11]

در شکست عملیات والفجر مقدماتی نیز، ردپای ستون پنجم سازمان مجاهدین خلق دیده می‌شود. محسن صرب ‌اهرابی، از اعضای این سازمان بود که با نفوذ در واحد اطلاعات عملیات تیپ 27 محمد رسول‌الله «ص» سپاه پاسداران، در شناسایی منطقه عملیاتی والفجر مقدماتی مشارکت داشت که همزمان با عملیات ناپدید شد. اهرابی چندی بعد، ‌در مصاحبه با رادیو عراق، به نقش خود در افشای این عملیات پرداخت. وی پس از پایان جنگ تحمیلی، به همراه اسرای ایرانی به کشور بازگشت و پس از شناسایی و محاکمه اعدام شد.⁠[12]

علاوه بر منافقین، شاخه نظامی مخفی حزب توده موسوم به «نوید»، متشکل از افرادی نظیر سرهنگ هوشنگ عطاریان (فرمانده قرارگاه مقدم غرب نزاجا) و ناخدایکم بهرام افضلی (فرمانده نیروی دریایی ارتش) نیز در افشای اطلاعات مربوط به عملیات والفجر مقدماتی نقش داشتند که پس از محاکمه در دادگاه انقلاب، اعدام شدند.⁠[13]

سوءقصد به نیروهای ایرانی در مناطق عملیاتی و پشت جبهه، از دیگر اقدامات ستون پنجم دشمن بود. به‌عنوان نمونه، یکى از نیروهاى سپاه پاسداران متوجه می‌شود دو مین ضد خودرو در جاده زرین‌آباد ـ دهلران کار گذاشته شده است؛ ستون پنجم اهل دهلران این مین‌ها را کار گذاشته بودند که دستگیر شدند.⁠[14] در مورد دیگر، قاسم سلیمانی (شهید؛ فرمانده لشکر 41 ثارالله سپاه پاسداران در دفاع مقدس)، در بیمارستان قائم مشهد، مورد سوءقصد یکی از پزشکان عضو منافقین قرار گرفت اما با کمک یکی از پرستاران، نجات یافت.⁠[15]

پناهنده شدن برخی نظامیان به همراه ادوات جنگی، از دیگر اقدامات ستون پنجم در جنگ تحمیلی بود؛ سروان احمد مرادی طالمی (خلبان جنگنده اف-14) در سال 1364، به همراه جنگنده‌ خود، ابتدا به عراق و سپس به سوئیس پناهنده شد. وی سه ماه بعد، توسط یک ناشناس به قتل رسید.⁠[16] علی‌اکبر محمدی (خلبان هواپیمای غیر جنگی جت فالکن-20) نیز در سال 1365، با هواپیما ابتدا به عراق رفت و سپس به آلمان غربی پناهنده شد؛ وی پنج ماه بعد، در هامبورگ به دست دو ناشناس کشته شد.⁠[17]

ستون پنجم دشمن در پشت جبهه نیز اقداماتی مانند پخش تراکت‌های ضد جنگ؛ شعارنویسی در مکان‌های مختلف از جمله خیابان‌ها؛ آتش‌زدن خودرو و موتورسیکلت؛ از کار انداختن ادوات نظامی و در کل ایجاد خلل در مجموعه‌های نظامی انجام می‌داد.

  سازمان مجاهدین خلق در گزارش اقدامات خرابکارانه نیروهای خود، به اقداماتی نظیر از کار انداختن موتور یک فروند هواپیمای اف-4 نیروی هوایی ارتش، از کار انداختن موتور یک فروند هواپیمای سی-130، تخریب قفل اتاق‌های پایگاه دریایی خرمشهر، تخریب قفل درهای خودرو کارکنان پایگاه نیروی دریایی بندر امام خمینی، از کار انداختن توربین یک فروند هواپیمای سی-130، از کار انداختن سیستم ناوبری دو فروند جنگنده (تامکت) اف-14 در پایگاه هشتم شکاری اصفهان، از کار انداختن موتور دو فروند جنگنده (تامکت) اف-14 در سازمان صنایع هواپیمایی تهران، از کار انداختن یک دستگاه تانک چیفتن در صنایع تانک‌سازی مسجد سلیمان، تخریب قفل در اصلی ورودی مسجد پادگان ارتش در مسجدسلیمان، تخریب منبع بزرگ سوخت ترابری پادگان نیروی زمینی تبریز، به آتش کشیدن دو خودروی تویوتا استیشن سپاه پاسداران انقلاب اسلامی در میاندوآب، تخریب 21 قطعه از قطعات حساس دستگاه‌های   موجود در پادگان نیروی هوایی ارتش در تهران به ارزش تقریبی 35 هزار دلار، انهدام یک نفربر در پادگان نیروی زمینی ارتش در تبریز، از کار انداختن موتور 7 کامیون نیروی زمینی ارتش در خاش و تخریب درِ انبار پادگان قصر و پادگان تیپ ذوالفقار اشاره کرده است.⁠[18]

در بعد سیاسی نیز، گروه‌های مخالف انقلاب اسلامی در پی تضعیف حکومت ایران برآمدند که اقدامات نهضت آزادی ایران در مخالفت با دفاع در مقابل متجاوزان بعثی از همه مشهودتر است.⁠[19]